En la historia prehispánica, el territorio de Querétaro se inscribe en una región conocida como Centro-Norte de México, la cual fue ocupada por diversos grupos: otomíes, nahuas, tarascos, pames y jonaces, entre otros.

En esta sala el visitante conocerá la relación de intercambio, organización y política de los grupos que se asentaron en el territorio queretano en este periodo. Destaca la formación de los primeros asentamientos agrícolas a orillas del río San Juan, los pueblos que ocuparon el valle de Querétaro y que recibieron el impacto y la presencia del Estado teotihuacano; más tarde se ve la clara influencia tolteca en la zona arqueológica El Cerrito. En la Sierra Gorda, se destacan rasgos culturales propios que son representativos de las zonas arqueológicas de Ranas, Toluquilla y San Rafael. En esta área sobresale como actividad principal la minería, de donde se extraía el cinabrio que era utilizado en ceremonias rituales.

En la sala de Pueblos Indios se puede conocer acerca del territorio de Querétaro, en donde se muestra la mayor parte de la población indígena representada por los pueblos otomíes (ñäñho o ñöñhö), asentados  geográficamente en varios municipios, entre ellos, Amealco, Tolimán y, en menor medida, Cadereyta, Ezequiel Montes, Colón y Peñamiller.

Además, es posible observar sus expresiones culturales propias relacionadas con su origen, los cambios estacionales, las etapas del ciclo agrícola, el ciclo de la vida, la muerte, su actividad ritual y los símbolos que nutren la devoción de las comunidades.

Muestra la historia, las características y la evolución del antiguo “Convento Grande de Santiago de la regular observancia de San Francisco”. Desde sus orígenes, en el siglo XVI, este convento fue el centro de la vida social y espiritual, así como el eje articulador del espacio urbano en Querétaro. Su temática concluye con la inauguración del Museo Regional en el Convento Franciscano.

Muestra la historia de la fusión de diversos grupos sociales, creencias y costumbres que constituyen la actual cultura mexicana. El discurso museológico aborda temas que inician con la reconfiguración de la sociedad y la integración de una población criolla; siguen con la descripción de los procesos económicos asociados a la estratégica ubicación en el itinerario del Camino Real de Tierra Adentro; sigue con la relevancia de Querétaro adquirida gracias a la solidez de las instituciones coloniales tanto religiosas como civiles; y termina con una sala dedicada a Cadereyta y la Sierra Gorda, que fuera una Alcaldía Mayor y se convertiría en parte del estado de Querétaro a mediados del siglo XIX.

La temática de la sala Querétaro en la Historia Mexicana parte del siglo XVIII con la promulgación de las Reformas Borbónicas y su impacto en la Nueva España al introducir, entre otros cambios, nuevos paradigmas de un sistema liberal que lograra una mayor obtención de riqueza por parte de España hacia sus colonias. En consecuencia, a partir de 1810 y hasta 1821, se gestó el movimiento de independencia en la Nueva España con el cual, se buscó la consolidación de una nueva identidad y sobre todo, una nación.

Esta sala termina en los sucesos de la guerra entre México y Estados Unidos (1846-48) cuyo resultado fue la pérdida de una inmensa cantidad de territorio mexicano, siendo este acontecimiento uno de los de mayor relevancia en la historia del país.

La segunda parte de la sala de Querétaro en la Historia Mexicana muestra los diversos procesos y grandes contrastes del país, en donde el estado de Querétaro fue un protagonista durante conflictos, guerras civiles y dictaduras. Asimismo, da cuenta del afán de modernización y construcción de una nación.

La sala comienza con la Guerra de Reforma de 1857-1861 donde liberales y conservadores pelearon por el control del país, pasando por la Intervención Francesa y la llegada de Maximiliano de Habsburgo hasta el periodo conocido como el Porfiriato, la Revolución mexicana y su desenlace con la firma de la Constitución de 1917, dando así cuenta, del constante y vigente afán de modernización y construcción de la nación mexicana.

La Sala Magna, ubicada en la antigua librería del convento franciscano, resguarda esculturas, pinturas y mobiliario característicos de los siglos XVII y XVIII, principalmente de carácter religioso. Alberga importantes lienzos de Luis Juárez, José de Ibarra, Juan Correa y Miguel Cabrera, principales exponentes de la pintura novohispana.

En este espacio se presenta una extraordinaria colección de pinturas al óleo sobre la vida de San Ignacio de Loyola, con formato dispuesto en arcos de medio punto, de la autoría del pintor novohispano Miguel Cabrera, artista predilecto de la Compañía de Jesús en la Nueva España a mediados del Siglo XVIII.

El conjunto de lienzos destaca la importancia que tuvieron los jesuitas en la formación de las élites criollas de la Nueva España y de Querétaro. Ellos impactaron en la la formación de una identidad y una mentalidad propia de los criollos, sentando las bases para la construcción de una idea de patria americana.

El corredor de los Ángeles Pasionarios está conformado por 14 óleos del siglo XVIII de autor anónimo. Pertenecen a la colección virreinal del museo y, a través de alegorías y símbolos, narran las diferentes escenas de la Pasión de Cristo, desde la Última Cena hasta la crucifixión, muerte y resurrección.